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高效液相色谱仪（HPLC）是医药、食品、环境检测实验室核心分析设备，规范操作直接决定数据准确性与色谱柱使用寿命。本文整理标准化 HPLC 操作步骤，从流动相预处理、开机平衡、手动进样到缓冲盐系统关机冲洗完整实操流程；同时汇总液相色谱仪压力异常、峰形畸变、基线不稳等高频故障的排查与解决办法，新手操作人员可直接对照执行，适配99905银河官方网站全系列液相色谱仪器。

高效液相色谱仪（HPLC）操作使用步骤

核心原则： 不同品牌和型号的 HPLC，操作细节会有点差异，但核心思路和操作逻辑是相通的。记住 “开机先冲洗，关机要冲净” 这条老规矩，准没错。

一、 分析前的准备（“兵马未动，粮草先行”）

流动相准备：

溶剂选择：得用 HPLC 级或更纯的溶剂，不然杂质容易干扰，基线也会乱糟糟。

水的纯度：用 18.2 MΩ・cm 的超纯水，好现用现制，以免久放的水里滋生微生物损坏色谱柱，影响检测。

过滤：所有流动相使用前一定要用 0.45 μm 或 0.22 μm 的滤膜真空抽滤，把小颗粒滤掉，不然堵了系统或色谱柱，麻烦就大了。

脱气： 流动相里的气泡得除掉，不然泵或检测器里冒泡，压力不稳，基线也会跳。常用的方法有在线脱气、超声、氦气鼓泡、抽滤等。

样品准备：

样品得溶彻底，溶液要清亮，不能有固体颗粒。

建议用和流动相初始比例差不多的溶剂溶样品，不然容易出现溶剂效应，峰形会变丑。

特别提醒： 样品溶液上机前，一定要用 0.22 μm 的针头过滤器滤一下。

色谱柱检查：

确认所用的色谱柱类型（C18、C8、氨基柱等）与分析方法、样品性质等是否对得上。

看看柱效卡，色谱柱的柱效和压力应该在能接受的范围内。

检查实验室环境：

废液瓶得有足够空间，电源、气体（需要的话）都得正常。

二、 开机、冲洗与平衡系统（“热身运动”）

正确开机顺序：

打开电脑→开仪器电源（让各模块通电）→启动工作站软件。

这么做是为了让软件顺利识别并连接各个模块，少出岔子。

安装色谱柱与系统冲洗：

把色谱柱接到流路里，注意色谱柱标签上的箭头应与流动相流向一致。

关键步骤： 先用低流速（比如 0.2-0.5 mL/min）开泵，用当前方法需要的流动相比例，慢慢调到工作时的流速。这样能避免高压冲击坏色谱柱和系统。

检查各个接口有没有漏液。

系统平衡：

保持工作流速，让流动相一直冲洗色谱柱和整个流路，直到：

基线平稳： 工作站上的信号线成一条直线，不漂移、没毛刺。

压力稳定： 系统压力波动一般要小于 ±1%。

平衡时间通常 10-30 分钟，梯度方法可能得更久。

三、 方法设置与样品分析（“核心执行”）

创建/调用方法： 在色谱工作软件里把参数设准，包括流速、流动相比例、柱温箱温度、检测波长、运行时间、进样量等。

基线观察： 确认基线稳定后，再准备进样。

进样操作（没有进样触发分析启动功能的手动进样方式）：

用合适的进样针，先用样品溶液润洗几次，再吸入比进样量稍多的体积。

把进样阀扳到 “Load” 位置，针完全插进进样口，快速把样品注进去，然后拔针。

随后立即把进样阀扳到 “Inject” 位置，同时在工作站上点 “Start” 开始采数据。

注意： 动作得快、衔接要顺，别在 “Load” 和 “Inject” 之间停太久。

四、 关机与维护（善后工作不能马虎）

系统冲洗（重要的一步！）：

分析结束后，可千万别直接停泵。

根据使用的流动相的类型，选合适的溶剂把系统彻底冲干净。

如果用了缓冲盐： 先用高比例水（比如 90% 水）冲 30-60 分钟，把盐分洗掉；再用高比例有机相（比如 90% 甲醇或乙腈）冲 30-60 分钟，把水分换掉，免得滋生微生物或析出盐。

如果没⽤缓冲盐： 直接用90% 甲醇或乙腈高比例有机相冲 30 分钟以上就行。

正确关机顺序：

停泵→关检测器灯（尤其是 UV 灯，能延长寿命）→关工作站软件→关仪器电源→后关电脑。

色谱柱保存：

卸下色谱柱，两端盖上塞子，按说明书要求存（反相色谱柱一般存纯甲醇或乙腈里）。

登记记录： 填好仪器使用记录，写上使用人、样品、方法、仪器状态这些，方便以后查询。

HPLC 使用常见问题（Troubleshooting）及解决方案

液相色谱仪新手常见问答：

Q1：高效液相色谱仪开机顺序是什么？
A：先开电脑→仪器电源→启动工作站软件，安装色谱柱后低流速冲洗平衡，基线平稳再进样。

Q2：流动相含缓冲盐，关机必须冲洗多久？
A：先用 90% 水相冲洗 30-60 分钟除盐，再用 90% 甲醇 / 乙腈冲洗 30 分钟以上，防止盐结晶堵管路。

Q3：液相色谱峰拖尾怎么快速解决？
A：更换污染保护柱、流动相添加三乙胺扫尾剂、稀释样品降低进样量、重新平衡色谱柱。

Q4：系统压力波动大是什么原因？
A：管路存在气泡、单向阀污染磨损、脱气机故障、流动相未充分脱气，依次排气、清洗单向阀即可改善。

Q5：C18 反相色谱柱长期不用如何保存？
A：冲洗干净后保存在纯甲醇或乙腈中，两端密封堵头，阴凉避光存放。

掌握这套高效液相色谱仪操作与维护规范，坚持 “开机先冲洗，关机冲净缓冲盐” 核心原则，能大幅降低色谱柱堵塞、基线漂移、压力波动等故障发生率。若遇到复杂 HPLC 设备报错、色谱柱不可逆污染、泵体漏液等问题，可联系99905银河官方网站液相售后获取一对一仪器检修指导。